Genetică medico-legală
Prof. Univ. Dr Sorin Hostiuc
UMF Carol Davila București
Ce este genetica?
Genetica este studiul eredității și al variației trăsăturilor biologice.
Aplicații ale geneticii
Genetica are aplicații importante în medicină, agricultură, biologie și multe alte domenii.
Utilitatea analizei genetice în ML
Identificare
  • victimă în omoruri (inclusiv pruncucidere), accidente aviatice, incendii, explozii nucleare;
  • agresori sexuali - cea mai frecventă;
  • autorii tâlhăriilor, furturilor, actelor de heteroagresiune (inclusiv crimă).
Filiație
  • cercetarea paternității;
  • cercetarea maternității (schimburi accidentale de copii, nou născuți abandonați);
  • identificare a adopțiilor ilegale.
Alte utilizări
  • antropologie medico-legală/paleoantropologie/studii populaționale
  • identificare a unor afecțiuni genetice în morți subite (ex.canalopatii).
Probe biologice ce pot fi utilizate
Cel mai frecvent
Celule epiteliale bucale
Sânge – necesită cantități ceva mai mari, majoritatea elementelor celulare fiind anucleate (hematii).
Țesuturi și secreții
Mușchi scheletic – se recomandă prelevarea la sala de autopsie, pe lângă sânge.
Alte fragmente de organe
Atenție: putrefacția și invazia bacteriană determină hidroliza atipică a ADN rezultând fragmente de lungimi variabile ce duc la erori de interpretare a rezultatelor.
Pete și fire de păr
Pete de sânge/spermă – diametrul minim recomandat – 0,5-1 cm.
Secreție vaginală – recomandabil prelevarea a 3 probe în tuburi din plastic.
Fire de păr – minim 10-20 cu rădăcină (fără nu sunt utile pentru analiza STR).
Alte surse
Unghii, salivă, urină – poate fi obținut material genetic suficient pentru analiză.
Pulpă dentară – utilă în cazul în care au acționat factori de mediu extremi (ex.temp foarte ridicate) ce au determinat distrugeri tisulare masive.
Metode
Analiza STR
Caracteristici STR
Fragmente de ADN alcătuite din două sau mai multe nucleotide (nu mai mult de 50) care se repetă un număr variabil de ori într-o anumită zonă a ADN-ului.
Peste 10000 în genomul uman.
Utilizare în genetica medico-legală
Metoda cea mai des utilizată în genetica medico-legală în scopul tipării ADN-ului.
Pentru a putea identifica o persoana cu o probabilitate statistic crescută este necesară analiza unui număr de 10-16 loci STR.
Criterii pentru utilizare în analize:
  • polimorf (prezintă un număr diferit de repetiții la diferiți indivizi în același locus genetic)
  • unilocus (cu localizare unică pe genom)
  • format din tetra sau penta repetiții
  • cu un număr minim de artefacte genetice
Analiza STR vizual
Analiza STR (Short Tandem Repeat) este o metodă de analiză genetică folosită în medicina legală pentru identificarea persoanelor. Această tehnică se bazează pe examinarea regiunilor repetitive ale ADN-ului, numite STR-uri, care variază în lungime între indivizi.
Fiecare coloană reprezintă un locus STR specific, iar vârfurile indică alele prezente la acel locus. Înălțimea vârfurilor reflectă cantitatea relativă de ADN pentru fiecare alelă.
Secvențierea ADNmt
Caracteristici ADNmt
  • Transmitere pe linie maternă
  • rată de mutații mai mare decât ADN nuclear
  • circular => rezistență mai mare la degradare
  • Nu conține secvențe repetitive
  • prezintă o zonă înalt polimorfă numita bucla D (D-loop) - analizată prin tehnici de secvențiere moleculară
Utilitate maximă pentru
  • Produse scheletizate
  • Antropologie medico-legală
  • Filiație (ex. Cazul Romanovilor)
Spre deosebire de analiza STR secvențierea ADNmt poate fi utilizată pentru analiza firelor de par unice, fără rădăcină.
Dezavantaj
Nefiind unic, ADNmt nu poate fi utilizat pentru identificări criminalistice sau pentru analiza paternității.
Înrudirea diferitelor populații pe baza ADNmt
Analiza Y-STR (STR de pe cromozomul Y)
  • utilitate crescută în cazurile în care avem amestec de material genetic masculin și feminin.
  • markeri de elecție pentru cercetarea paternității.
  • dezavantaj - se transmit pe linie paternă, deci fiul nu poate fi diferențiat de tată.
Analiza SNP
Identificarea variațiilor
Analiza SNP identifică variațiile unei singure nucleotide.
Prezente în genom cu o frecvență de aproximativ 1/1000 baze azotate.
Bialelică
Deși numărul lor este mult mai mare decât al STR-urilor, capacitatea lor discriminativă este mult mai mică deoarece sunt de regulă bialelice (pentru fiecare locus SNP există două variante, în timp ce în cazul STR-urilor numărul variațiilor alelice este mult mai mare).
Nr minim necesar pentru analize de genetică medico-legală
Utilizarea a 30-40 de loci SNP diferiți are aceeași capacitate discriminativă ca utilizarea a 13 loci STR.
Material genetic degradat
Utilitate crescută dacă lucrăm cu material genetic foarte degradat, SNP-urile putând fi identificate și pe fragmente de 100 baze, pe care analiza STR nu poate fi efectuată.
Utilizare curentă:
  • antropologia medico-legală
  • accidente cu număr mare de victime (victimele de la World Trade Center)
  • analiza originii etnice/populaționale a unei persoane (unele SNP-uri sunt specifice anumitor populații).
Dinții ca sursă de ADN
  • extrem de rezistenți la fenomene postmortem, inclusiv putrefacție, autoliză, imersie în apă, incendii de până la 1100 grade C
  • celulele neurovasculare pulpare și (într-o măsură mai mică) odontoblaștii inclavați în stratul de predentină în timpul mineralizării tubulilor dentinali sunt extrem de utili pentru obținerea de material genetic atunci când alte surse nu mai pot fi utilizate
Metodologie de lucru

1

2

3

4

1

Evaluare integritate dinte

2

Alegere metodă (este sau nu necesară păstrarea integrității dentare?)

3

Prelevare probe

4

Analiză ADN
Dacă trebuie păstrată integritatea dintelui (necesar pentru alte evaluări antropometrice sau datorită importanței culturale/istorice)
  • incizii orizontale la nivelul joncțiunii smalț-cement, prin care se expune camera pulpară și sistemul radicular pulpar, predentina și dentina, de unde se preiau probe biologice
  • ex. – testul ADN pentru familia Romanovilor, stabilirea familiei extinse a lui G. Washington, dezastre în masă)
  • utilizarea unei pompe microfluidice pentru spălarea celulelor nucleate din pulpa dentară, urmată de captarea lor la trecerea prin microorificii la nivelul suprafeței ocluzale (Krzyzanska)
Dacă nu este necesară păstrarea integrității dintelui
  • zdrobirea și măcinarea dintelui/dinților într-o pudră fină, fapt ce maximizează captarea de ADN
Obținerea de ADN din salivă
Surse de ADN din salivă
  • din cavitatea bucală a victimei/agresorului sau pe suprafețe (inclusiv tegument)
  • în viol/agresiuni sexuale – recoltarea de material genetic se face țintit de anamneză
  • necesară prelevarea de probe control din cavitatea bucală a victimei
Identificarea tipului de produs biologic
înainte de identificarea ADN-ului din proba de salivă de pe suprafețe se face identificarea tipului de produs biologic (este/nu este salivă):
  • lumină ultraviolet.
  • Avantaj – ieftină, ușor de utilizat.
  • Dezavantaj – poate distruge integritatea ADN. NU se recomandă
  • lasere sau lumini cu intensitate înaltă filtrare pe o singură undă.
  • Avantaj – nu distruge integritatea ADN.
  • Dezavantaj: Sunt mai greu disponibile.
  • teste biochimice – identificarea alfa-amilazei.
  • Avantaj: ieftină (kituri rapide), structură stabilă in vitro.
  • Dezavantaj – consumă material biologic, astfel că rămâne mai puțin pentru extracții ADN
Exemple
Cazul Romanovilor
În iulie 1991 au fost scoase dintr-un mormânt din Ekaterinburg 9 cadavre pe care medicii legiști ruși le-au considerat a fi ale ultimului țar, țarinei, a trei dintre copiii lor, medicului regal și a trei servitori.
Pentru confirmarea existenței unei familii în mormânt s-a efectuat analiza STR și ADNmt.
Analiza cromozomială
Testul amelogeninei
- proteină implicată în dezvoltarea dentară
- gena - localizată atât pe cromozomul X (Xp22.1-Xp22.3) cât și Y (Yp 11.2)
Gene și amplificoni
- gena de pe cr X=AMELX -> duce la apariția unui produs de amplificare (amplicon) de 106pb (deleție de 6pb din intronul 1 pe gena situată pe cromozomul X)
- gena de pe cr Y = AMELY -> duce la apariția unui produs de amplificare (amplicon) de 112pb
Metoda
  • amplificarea produsului biologic prin PCR (se utilizează primeri specifici pentru intronul 1 al genei)
  • analiza ampliconilor prin electroforeză pe gel
  • sex masculin – 2 benzi în gelul de agar
  • sex feminin – o bandîă în gelul de agar
Analiza STR
Analiza STR – 5 loci tetramerici
Analiza Y-STR
Analiza ADNmt vizual
Copernicus
Copernicus a fost îngropat într-o catedrală din Frombork, pe malurile râului Vistula, dar nimeni nu a știut exact unde.
În 2005, o echipă de arheologi a explorat Altarul Sfintei Cruci, unul dintre cele 16 altare ale Catedralei, unde au identificat 13 schelete, dintre care unul corespundea unui bărbat de circa 70 de ani (posibil Copernicus).
Copernicus identificare
Pentru a fi siguri de identificare, profilul genetic, obținut pe baza ADN-ului prelevat din dinți, a fost comparat cu ADNmt din niște fire de păr găsite în cartea Calendarium Romanum Magnum, scrisă de Johannes Stoeffler, pe care Copernicus a deținut-o toată viața. Profilurile genetice au fost identice, fiind deci realizată o identificare pozitivă
Copilul de pe Titanic
  • 15 Aprilie 1912, vasul Titanic s-a scufundat lor nemaifiind găsite niciodată.
  • 21 aprilie a fost descoperit cadavrului unui copil, care a fost îngropat într-un cimitir din Halifax, Canada.
  • 1998, cadavrul a fost exhumat, la cererea familiei Palsson din Suedia, ce a crezut că respectivul copil era Gosta Leonard Pwallson, care avea 2 ani și trei luni la data scufundării Titanicului.
Copilul de pe Titanic identificare
Exhumare și analiză dentară
În cursul exhumării au fost recuperați trei dinți (55,73,84). Dintre cei trei dinți, 84 a conținut dentină pe când 55 și 73 – nu.
Determinarea vârstei
Pe baza acestor analizei dentare, s-a stabilit că vârsta copilului era de 9-15 luni, neputând avea 27 de luni.
Analiza genetică suplimentară
Ulterior, cercetătorii de la Universitatea Brigham Young din Utah au izolat ADNmt din dentină și au comparat profilul cu cel al descendenților tuturor mamelor care au fost pe Titanic și care au avut copii de sub 3 ani care să fi murit în accident.
Profilul obținut a sugerat posibilitatea ca el să fie fie un băiat de 19 luni, fie unul de 13 luni.
Având în vedere că primul frate era prea mare, s-a ajuns la concluzia că respectivul cadavru aparținea unui copil de 13 luni, pe nume Eino Viljam Panul.
Concluzie finală
Ulterior însă, a fost identificată o pereche de pantofi, care aparținea copilului, și pe care polițistul care a descoperit cadavrul le-a păstrat.
Acești pantofi erau prea mari pentru a fi purtați de un copil de 13 luni.
S-a realizat o nouă analiză genetică (ADNmt), care a identificat o diferență la nivelul unei perechi de baze, profilul fiind identic cu cel al fetei de 19 luni.
Prin urmare, pe baza noilor date, s-a concluzionat că scheletul aparținea unei fete pe nume Sidney Goodwin.